Список тем
1. Известно, что клеточная линия HEK 293 была получена в 1973 году трансформацией культуры клеток эмбриональных почек человека аденовирусом. Сейчас известно, что для повторения подобного эксперимента не нужен весь геном аденовируса, а достаточно лишь нескольких генов. Перечислите необходимые гены. Найдите последовательность аденовируса вируса (5-й серотип) в базе данных NCBI, скачайте геном и на карте-схеме выделите область этих генов. Опишите основные функции этих генов. Задание необходимо выполнить в ПО SnapGene.
2. Вам необходимо наработать в клетках млекопитающих рекомбинантный гетеродимерный белок. Предложите подходы, которые позволили бы экспрессировать в одной клетке обе полипептидные цепи приблизительно в эквимолярных количествах.
3. Вам необходимо получить генетический вектор, в котором с одной рамки считывания будет идти экспрессия двух разных генов, но при этом у вас есть ограничения по размеру экспрессионной кассеты и использовать два разных промотора не представляет возможности. Можно ли использовать вирусные элементы для решения этой проблемы? Если есть, то назовите эти элементы и опишите механизм работы этих элементов.
4. Вы разрабатываете генотерапевтический препарат на основе rAAV для заместительной генной терапии Спинальной мышечной атрофии, вызванной дефицитом белка SMN. При данном заболевании в первую очередь страдают нейроны, что вызывает гибель пациента в раннем возрасте. Получив прототип препарата вы хотите испытать его работоспособность в тесте in vitro. У вас в наличии есть культура клеток фибробластов от пациента. К сожалению, данные клетки не трансдуцируются разработанным препаратом. Опишите подробно как бы вы стали решать данную задачу.
5. Напишите литобзор на тему: "Методы наработки рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов. Преимущества и недостатки"
6. Сделайте обзор методов трансфекции клеток млекопитающих: их преимущества и недостатки. Задача: Какой объем (мкл) клеточной суспензии необходим для пересева HEK293T?Условие: адгезионную клеточную линию HEK293T необходимо засеять в культуральный флакон площадью 225 см^2 с посевной концентрацией клеток 0,01*10^6 клеток/см^2. Имеется 7 мл клеточной суспензии HEK293T с концентрацией клеток 4,3*10^6 клеток/мл.
7. Сделайте обзор систем доставки трансгена в клетки (трансдукция/трансфекция), критерии выбора, их преимущества и недостатки. Задача: Какой объем (мкл) клеточной суспензии необходим для пересева клеток линии Huh-7? Условие: адгезионную клеточную линию Huh-7 необходимо засеять в культуральный флакон площадью 75 см^2 с посевной концентрацией клеток 10 000 клеток/см^2. После снятия имеется 5 мл клеточной суспензии с концентрацией клеток 6,2*10^6 клеток/мл.
8. Сделайте обзор клеточных линий-продуцентов для наработки аденоассоциированных вирусных векторов: их преимущества и недостатки, возможные способы получения, типы систем индукции и их назначение. Задача: Какой объем (мл) клеточной суспензии необходим для пересева клеток линии HEK293? Условие: суспензионную клеточную линию HEK293 необходимо засеять в культуральную колбу объемом 125 мл (рабочий объем 30 мл) с посевной концентрацией клеток 600000 клеток/мл. В исходной колбе концентрация клеток 3,8*10^6 клеток/мл.
9. Напишите литобзор на тему "Особенности различных методов очистки AAV, используемые в различных форматах наработки : от лабораторного до производственного "
10. В генной инженерии широко используются методы получения рекомбинантных ДНК как сборка по Гибсону и SLIC. Сравните данные два метода, в чем их сходство и различия. Вам необходимо получить рекомбинантную ДНК соединив два фрагмента – один получен путем обработки сайт-специфическими эндонуклеазами и содержит 5’-выступающие липкие концы. Второй фрагмент получен с использованием ПЦР. Что надо иметь в виду при дизайне праймеров, необходимых для получения второго фрагмента, при сборке целевой молекулы ДНК тем или иным методом?
2. Вам необходимо наработать в клетках млекопитающих рекомбинантный гетеродимерный белок. Предложите подходы, которые позволили бы экспрессировать в одной клетке обе полипептидные цепи приблизительно в эквимолярных количествах.
3. Вам необходимо получить генетический вектор, в котором с одной рамки считывания будет идти экспрессия двух разных генов, но при этом у вас есть ограничения по размеру экспрессионной кассеты и использовать два разных промотора не представляет возможности. Можно ли использовать вирусные элементы для решения этой проблемы? Если есть, то назовите эти элементы и опишите механизм работы этих элементов.
4. Вы разрабатываете генотерапевтический препарат на основе rAAV для заместительной генной терапии Спинальной мышечной атрофии, вызванной дефицитом белка SMN. При данном заболевании в первую очередь страдают нейроны, что вызывает гибель пациента в раннем возрасте. Получив прототип препарата вы хотите испытать его работоспособность в тесте in vitro. У вас в наличии есть культура клеток фибробластов от пациента. К сожалению, данные клетки не трансдуцируются разработанным препаратом. Опишите подробно как бы вы стали решать данную задачу.
5. Напишите литобзор на тему: "Методы наработки рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов. Преимущества и недостатки"
6. Сделайте обзор методов трансфекции клеток млекопитающих: их преимущества и недостатки. Задача: Какой объем (мкл) клеточной суспензии необходим для пересева HEK293T?Условие: адгезионную клеточную линию HEK293T необходимо засеять в культуральный флакон площадью 225 см^2 с посевной концентрацией клеток 0,01*10^6 клеток/см^2. Имеется 7 мл клеточной суспензии HEK293T с концентрацией клеток 4,3*10^6 клеток/мл.
7. Сделайте обзор систем доставки трансгена в клетки (трансдукция/трансфекция), критерии выбора, их преимущества и недостатки. Задача: Какой объем (мкл) клеточной суспензии необходим для пересева клеток линии Huh-7? Условие: адгезионную клеточную линию Huh-7 необходимо засеять в культуральный флакон площадью 75 см^2 с посевной концентрацией клеток 10 000 клеток/см^2. После снятия имеется 5 мл клеточной суспензии с концентрацией клеток 6,2*10^6 клеток/мл.
8. Сделайте обзор клеточных линий-продуцентов для наработки аденоассоциированных вирусных векторов: их преимущества и недостатки, возможные способы получения, типы систем индукции и их назначение. Задача: Какой объем (мл) клеточной суспензии необходим для пересева клеток линии HEK293? Условие: суспензионную клеточную линию HEK293 необходимо засеять в культуральную колбу объемом 125 мл (рабочий объем 30 мл) с посевной концентрацией клеток 600000 клеток/мл. В исходной колбе концентрация клеток 3,8*10^6 клеток/мл.
9. Напишите литобзор на тему "Особенности различных методов очистки AAV, используемые в различных форматах наработки : от лабораторного до производственного "
10. В генной инженерии широко используются методы получения рекомбинантных ДНК как сборка по Гибсону и SLIC. Сравните данные два метода, в чем их сходство и различия. Вам необходимо получить рекомбинантную ДНК соединив два фрагмента – один получен путем обработки сайт-специфическими эндонуклеазами и содержит 5’-выступающие липкие концы. Второй фрагмент получен с использованием ПЦР. Что надо иметь в виду при дизайне праймеров, необходимых для получения второго фрагмента, при сборке целевой молекулы ДНК тем или иным методом?